Analyse de Bacillus Subtilis dans les préparations microbiennes d'aliments pour animaux
SCI 65.120 Cn° de classement : B 46
GB/T 26428-2010
PNormes nationales de la République populaire de Chine
Norme de test pour Bacillus subtilis dans les aliments pour animaux
Émis le : 2011-01-14
Mis en œuvre : 2011-07-01
Délivré par:PAdministration générale de la supervision de la qualité, de l'inspection et de la quarantaine de la République populaire de Chine et Comité national de gestion de la normalisation de la Chine
Avant-propos
Cette norme est rédigée conformément aux réglementations GB/T 1.1-2009.
Cette norme relève de la compétence du Comité technique national de normalisation de l'industrie de l'alimentation animale (SAC/TC 76).
Cette norme a été proposée et rédigée par : Le Centre d'analyses et d'essais microbiologiques de la province du Guangdong.
Les principaux rédacteurs de cette norme sont : Honghui Zhu, Xiaotang Sun, Songzhen Yang, Yuanliang Chen et Xianjiao Zhang.
Analyse de Bacillus Subtilis dans les préparations microbiennes d'aliments pour animaux
1. Champ d'application
Cette norme définit les réglementations pour les tests de bacillus subtilis dans les préparations microbiennes d'aliments pour animaux.
La présente norme s'applique aux essais et aux calculs de bacillus subtilis dans les préparations microbiennes d'aliments pour animaux.
2. Références normatives
Les documents suivants sont indispensables à l'application de ce document. Pour les références datées, seule la version datée s'applique à ce document. Pour les documents cités sans date, la dernière version (y compris tous les amendements) s'applique à ce document :
Règles d'arrondi numérique GB/T 8170, et expression et jugement des valeurs limites
GB/T 14699.1 Échantillonnage d'alimentation (GB/T 14699.1 – 2005, ISO 6497 : 2002, IDT)
GB/T 20195 Aliments pour animaux : Préparation des échantillons (GB/T 20195 – 2006, ISO 6498 : 1998, IDT)
3. Diluants, milieux et réactifs
Sauf indication contraire, seuls des réactifs analytiquement purs et de l'eau distillée ou désionisée ou d'une pureté équivalente doivent être utilisés dans l'analyse.
3.1. 0,85 % de solution saline stérilisée
3.2. Milieu de gélose nutritionnelle (NA), voir A.1 de l'annexe A
3.3. Solution de coloration de Gram, voir A.2 de l'annexe A
3.4. Milieu de croissance à 7 % de chlorure de sodium, voir A.3 de l'annexe A
3.5. Test VP des milieux et des réactifs, voir A.4 de l'annexe A
3.6. Milieu de réduction des nitrates et réactifs, voir A.5 de l'annexe A
3.7. Milieu de fermentation D-mannitol, voir A.6 de l'annexe A
3.8. Milieu d'utilisation du propionate, voir A.7 de l'annexe A
4. Matériel et verrerie
En plus des équipements de laboratoire couramment utilisés en microbiologie, d'autres équipements et verrerie répertoriés comme suit :
4.1. Incubateur thermostatique : 37 ºC ± 1 ºC
4.2. pH-mètre, précis à ± 0,1 unité
4.3. Boîte de pétri en verre ou en plastique
4.4. Pipette graduée avec des capacités de marquage de 1 ml et 10 ml, avec une échelle minimale de 0,1 ml et 0,5 ml respectivement
4.5. Tige en verre ou en plastique
4.6. Microscope, avec zoom 1000 fois
5. Échantillonnage
Les échantillons de test sont réels et représentatifs. Les outils d'échantillonnage tels que les pelles, les cuillères échantillonneurs, les éprouvettes, les bocaux, les ciseaux, etc. doivent être stérilisés.
Les échantillons doivent être envoyés à la salle d'analyse microbiologique dès que possible. La taille et la méthode d'échantillonnage doivent être mises en œuvre conformément à GB/T 14699.1.
6. Préparation de l'échantillon
La préparation de l'échantillon doit être mise en œuvre conformément à GB/T 20195, et l'échantillon doit être inspecté dès que possible après la préparation.
7. Procédures de fonctionnement
7.1. Préparation des échantillons pour l'inspection, la suspension initiale et la dilution au 1/10.
En utilisant des opérations et des conditions aseptiques, peser 25 g (ml) de l'échantillon, ajouter 225 ml de solution saline physiologique stérilisée à 0,85%, homogénéiser pendant 1-2 min et faire une suspension initiale de 1:10. Ensuite, prélevez 1 ml de la suspension initiale au 1:10, ajoutez 9 ml de sérum physiologique stérilisé à 0,85% et mélangez soigneusement pour obtenir une dilution au 1:100. Selon le contenu bactérien de l'échantillon, faites en outre une dilution décuplée en série.
7.2. Inoculation et culture
Choisir 2-3 dilutions appropriées, conserver et maintenir pendant 10 min au bain-marie à 80 ºC ± 1 ºC, prélever 0,1 ml avec une pipette stérile et ensemencer deux plaques de gélose nutritionnelle (3.2). Utilisez la tige de revêtement pour appliquer l'inoculum sur la surface de la gélose aussi soigneusement et rapidement que possible. La tige de revêtement ne doit pas toucher le bord de la boîte de Pétri. Utilisez une tige d'enrobage stérile pour chaque plat. Couvrir la boîte de Pétri enduite et laisser reposer à température ambiante pendant 15 min, afin que l'inoculum soit complètement absorbé par la gélose. Retourner la plaque et la placer dans un incubateur à 37 ºC ± 1 ºC pendant 48 ± 2 h.
7.3. Comptage et dépistage des colonies
Après incubation, sélectionnez une plaque avec un nombre de colonies entre 30 et 300. Si de grandes colonies en forme de flocons poussent dans le plat, son utilisation n'est pas déclarée. Cependant, si les colonies en forme de flocons représentent moins de la moitié de la boîte et que la répartition des colonies dans la moitié restante est très uniforme, vous pouvez calculer la moitié du nombre de colonies dans la boîte et multiplier le résultat par 2 pour représenter le nombre total de colonies de la boîte. La colonie typique de Bacillus Subtilis est rugueuse, opaque, non brillante, avec des bords dilatés, ronds ou ondulés, de forme irrégulière et d'apparence blanc grisâtre ou jaunâtre. Enfin, sélectionnez 5 colonies qui présentent ces caractéristiques pour la confirmation de l'expérience.
7.4. Test de validation
7.4.1. Aperçu
À l'heure actuelle, si le milieu de culture utilisé dans les kits d'identification biochimique commerciaux ou les tubes d'identification biochimique est le même que le milieu utilisé dans les tests de confirmation de cette norme, ces kits ou tubes peuvent être utilisés conformément aux instructions du produit pour effectuer cette confirmation. expérience.
7.4.2. Préparation de la souche
Choisissez une seule colonie de la boîte de Pétri et stries la culture sur la plaque de gélose nutritionnelle et cultivez à 37 ºC ± 1 ºC, pendant 48 ± 2 h. Au moins une colonie caractéristique bien isolée doit être prélevée dans chaque boîte, striée et transférée sur la boîte de gélose, et conservée pour les tests de confirmation.
7.4.3. Observation morphologique
Les colonies purifiées sélectionnées ont été examinées par microscopie à coloration de Gram (3.3). Les cellules de Bacillus subtilis doivent être en forme de bâtonnets, avec des spores de forme ovale, mésozoïques ou proches du mésozoïque, et les kystes ne doivent pas être agrandis de manière significative.
7.4.4. Test de confirmation physicochimique
Les colonies purifiées ont été sélectionnées pour les tests suivants : croissance de chlorure de sodium à 7 % (3,4), test VP (3,5), réduction des nitrates (3,6), fermentation du D-mannitol (3,7) et utilisation du propionate (3,8).
7.4.5. Confirmation des résultats
La confirmation des résultats est indiquée ci-dessous :
1. Les colonies de Bacillus Subtilis ont des surfaces rugueuses, sont opaques, d'aspect blanc grisâtre ou jaunâtre, sont en forme de tige avec des spores ovales, mésozoïques ou proches du mésozoïque, avec des kystes qui ne sont pas significativement agrandis.
2. Les résultats des tests sont positifs pour la croissance du chlorure de sodium à 7 %, le test VP et la réduction des nitrates.
3. L'acide peut être produit par fermentation du D-mannitol.
4. Il peut être jugé et déterminé comme Bacillus Subtilis sans utiliser de propionate.
Les caractéristiques distinctives de Bacillus Subtilis et des bactéries de type Bacillus sont présentées ci-dessous dans le tableau 1.
Tableau 1. Caractéristiques distinctives de Bacillus Subtilis et Bacillus-like Bacteria
| B. subtilis | B. Licheniformis | B. Céréus | B. Coagulants | B. Solide | B. Lent | B. Megaterium | B.Pumilus | |
Croissance anaérobie |
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Réduction des nitrates |
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Hydrolyse de l'amidon |
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Liquéfaction de la gélatine |
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Acide Production |
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Croissance du chlorure de sodium à 7 % |
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pH 5,7 Croissance |
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Noter:+ = positif ;- = négatif ;ré = Certaines souches sont positives ;ND = Indéterminé | |||||||||
8. Calcul des résultats et rapport
8.1. Calcul du nombre de colonies de Bacillus subtilis sur chaque boîte.
Calculer le nombre de colonies de Bacillus Subtilis (un) sur chaque plat en utilisant la Formule 1 :
Formule 1
un =(b ÷ A) x C
Légende:
un:Nombre de colonies de Bacillus Subtilis sur chaque boîte ;
b :Nombre de colonies confirmées comme étant des colonies de Bacillus subtilis après sélection de l'échantillon ;
UN:Nombre de colonies sélectionnées pour confirmation (5);
C :Nombre de colonies sur la boîte qui incarne les caractéristiques distinctives de Bacillus subtilis
Le résultat final (un) doit être arrondi au nombre entier le plus proche conformément aux règles d'arrondi numérique de GB/T 8170.
Par exemple:
S'il y a un total de 78 colonies sur la boîte qui présentent les caractéristiques de Bacillus Subtilis, 5 sont sélectionnées pour le test de confirmation, et 4 d'entre elles sont confirmées comme étant des colonies de Bacillus Subtilis, alors :
un= (4 / 5) × 78 = 62,4
un= 62,4 ~ 62
Selon les règles d'arrondi numérique de GB/T 8170, le nombre de colonies de Bacillus Subtilis (un) sur ce plat est de 62.
8.2. Nombre de colonies de Bacillus subtilis dans l'échantillon : méthode de calcul et rapport
Choisissez 2 boîtes de dilution en série (chaque dilution doit avoir au moins une boîte, avec un nombre confirmé de Bacillus Subtilis entre 30 et 300 sur la boîte.), Calculez en utilisant la Formule 2, qui est de 1 ml ou 1 g de Bacillus Subtilis dans l'échantillon , N
Formule 2
N = Ʃun /V (n1 + 0.1n2) · ré
Légende:
N :Le nombre total de Bacillus Subtilis dans l'échantillon ;
Ʃun:La somme totale de Bacillus Subtilis confirmés sur tous les plats ;
DANS:Volume d'inoculation de la boîte, ml ;
n1:Nombre de boites pour la première dilution ;
n2:Nombre de boites pour la seconde dilution ;
ré:Le facteur de dilution de la première dilution (la valeur derépour les échantillons non dilués est 1).
Le résultat final (N) doit être arrondi aux 2 chiffres significatifs les plus proches selon les règles d'arrondi numérique de GB/T 8170. Le nombre de colonies de Bacillus Subtilis dans l'échantillon peut également être enregistré à l'aide de la notation scientifique (1,0 – 9,9 fois 10X).
Indiquer le nombre estimé de Bacillus Subtilis par ml ou g d'échantillon, UFC/g ou UFC/ml.
Exemple 1:
Si après la première dilution (10-3), le nombre confirmé de colonies de Bacillus Subtilis est respectivement de 168 et 215, et après la deuxième dilution (10-4), le nombre confirmé de colonies de Bacillus Subtilis est respectivement de 34 et 35, alors :
N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0,1 x (2 + 0,1 · 2) x 10-3]
N = 472 / 0,00022
N = 2145450 ~ 2100000
Selon les règles d'arrondi numérique de GB/T 8170, le nombre estimé de Bacillus Subtilis de l'échantillon dans cet exemple en unités de g ou ml, est de 2100000 UFC/g (ou ml), soit 2,1 x 106 UFC/g (ou ml).
Exemple 2 :
Si la dernière dilution (10-4) confirme que le nombre de colonies de Bacillus Subtilis est respectivement de 120 et 130, alors :
N = (120 + 130) / (0,1 x 2 x 10-4)
N = 250 / 0,00002
N = 12500000 ~ 12000000
Selon les règles d'arrondi numérique de GB/T 8170, le nombre estimé de Bacillus Subtilis de l'échantillon dans cet exemple en unités de g ou ml, est de 12000000 UFC/g (ou ml), soit 1,2 x 107 UFC/g (ou ml).
