Quelle est la méthode de détection de l'activité des protéases alcalines?
Quelle est la méthode de détection de l'activité des protéases alcalines?
L'activité enzymatique fait référence à la capacité d'une enzyme à catalyser certaines réactions chimiques. La taille de l'activité enzymatique peut être exprimée par la vitesse d'une certaine réaction chimique qu'elle catalyse dans des conditions correspondantes. La mesure de l'activité de l'enzyme protéase alcaline du Liaoning mesure en fait la vitesse de la réaction chimique catalysée par l'enzyme. La vitesse de la réaction enzymatique peut être exprimée par la diminution du substrat réactionnel ou l'augmentation du produit par unité de temps. Par souci de sensibilité, la quantité de produit produit par unité de temps est généralement mesurée. Étant donné que la vitesse de la réaction enzymatique peut progressivement diminuer sa valeur d'augmentation avec le temps, afin de mesurer correctement l'activité enzymatique, la vitesse initiale de la réaction enzymatique doit être déterminée.
Principe de la détermination de l'activité des protéases alcalines Principe de la méthode Folin
La protéase alcaline peut catalyser l'hydrolyse de la caséine en tyrosine dans des conditions alcalines. La tyrosine est un acide aminé contenant un groupe hydroxyle phénolique et peut réagir avec la Folin (un mélange d'acide phosphotungstique et d'acide phosphomolybdique). (Réaction au phénol de Folin: le réactif de Folin est extrêmement instable dans des conditions alcalines, et il est facile d'être réduit quantitativement par des composés phénoliques pour produire un mélange de bleu de tungstène et de bleu de molybdène, montrant une nuance de bleu différente.) En utilisant la colorimétrie. la quantité de tyrosine produite peut être déterminée, et la quantité de tyrosine produite par l'hydrolyse de la caséine par la protéase alcaline de Liaoning en une unité de temps est utilisée pour exprimer l'activité enzymatique, calculant ainsi l'activité enzymatique.
Procédure expérimentale pour la détermination de l'activité protéase alcaline
Préparation de la solution enzymatique: peser avec précision 1 g (± 0,001) de poudre d'enzyme sèche, ajouter 10 ml de solution tampon (2.2.5), dissoudre dans un petit bécher et remuer avec une tige en verre. Après avoir laissé reposer pendant un moment, versez soigneusement la solution de la couche supérieure dans une fiole jaugée Au milieu, ajoutez une petite quantité de solution tampon à la partie sédiment, remuez et dissolvez 4 fois de cette manière, et enfin transférez le tout dans une fiole jaugée de 100 ml . Compléter jusqu'au trait avec une solution tampon, bien agiter et filtrer avec quatre couches de gaze. Prélever 5 ml de filtrat, le transférer dans une fiole jaugée de 100 ml, diluer jusqu'au trait avec de l'eau distillée et diluer l'enzyme liquide avec un niveau de 2000 fois.
Définition de l'activité protéase alcaline
Définition de l'unité d'activité protéase alcaline: 1 gramme de poudre de protéase alcaline peut produire 1 microgramme de tyrosine par minute dans les conditions de pH 10 et 40 ° C, ce qui est considéré comme une unité d'activité enzymatique.
Précautions pour la détermination de l'activité protéase alcaline
1. La température, le pH et la durée de la réaction enzymatique ont un impact direct sur le nombre de liaisons peptidiques hydrolysées, il doit donc être strictement contrôlé.
2. Après avoir terminé la réaction avec l'acide trichloracétique, le filtrat obtenu par filtration du mélange réactionnel doit être limpide.
3. Parce que le réactif Folin est sensible à l'environnement acide et est susceptible de changer, il y a une stipulation dans l'ordre pendant la mesure. Il est nécessaire d'ajouter une solution de carbonate de sodium pour former un environnement alcalin, puis d'ajouter du réactif Folin pour le faire fonctionner normalement.
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